Получение плюрипотентных стволовых клеток из семенников

[admin]

Наиболее активно исследуемыми в настоящее время видами плюрипотентных клеток человека являются ЭСК и iPS-клетки. Однако, не смотря на безусловный потенциал к дифференцировке, использование этих популяций клеток имеет свои ограничения – и в силу этических проблем, и в связи с особенностями получения (использование генных конструкций на основе ретровирусов). Поэтому проблема поиска подходящего источника плюрипотентных клеток для регенеративной медицины все еще актуальна.

У взрослых млекопитающих мужские половые клетки включают популяцию стволовых сперматогенных клеток (ССпК), которые обеспечивают постоянный сперматогенез в течение всей жизни. ССпК происходят от первичных половых клеток (ППК) эмбриона, которые имеют внегонадное происхождение и вступают в процесс дифференцировки после миграции в гонады. При культивировании ППК мышей и человека в определенных условиях формируются колонии плюрипотентных клеток, обладающих сходными с ЭСК характеристиками и получивших обозначение embryonic germ cells, EGCs [1, 2].

Могут ли из ССпК взрослых млекопитающих, аналогично ППК, формироваться колонии плюрипотентных клеток? Ответ на этот вопрос не был получен вплоть до недавнего времени, что, прежде всего, было обусловлено несовершенством методов селекции и культивирования сперматогенных клеток-предшественниц. Выделенные из протоков извитых семенных канальцев клетки даже на фидерном слое инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов быстро теряют пролиферативную активность [3]. Тем не менее, в 2003 г., используя специфический коктейль факторов роста, в состав которого входили нейротрофический глиальный фактор роста (glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF), EGF, bFGF и LIF, японской команде T. Shinohara удалось выделить и культивировать сперматогенные клетки-предшественницы мыши в течение длительного времени [4]. Более того, в 2004 г., эти же ученые описали cубпопуляцию ЭСК-подобных клеток, формирующихся при длительном культивировании сперматогенных клеток-предшественниц и, которые, возможно, являются аналогами EGCs [5]. Эти данные позднее были подтверждены в работах других научно-исследовательских групп [3, 6]. Тем не менее, возможность приобретения плюрипотентного статуса сперматогенными клетками-предшественницами человека в условиях длительного культивирования до настоящего времени оставалась неясной.

В журнале Nature опубликована работа европейских эмбриологов S. Conrad и соавт. (группа T. Scutella), в которой сообщается об успешном получении плюрипотентных клеток при культивировании ССпК взрослых людей. В качестве источника сперматогенных клеток авторы использовали материал, полученный в ходе биопсии тестикул 22 пациентов. Cуспензию клеток, полученную после механической и ферментативной обработки, культивировали в течение 4 сут. В среду для культивирования добавляли GDNF, критический фактор для культивирования ССпК, или сразу LIF, применяемый при культивировании ЭСК. В таких условиях клетки адгезировались ко дну чашки Петри. Затем, с помощью магнитной селекции (MACS) выделялись CD49f+ (маркер ССпК) клетки. Последующую селекцию проводили на чашках, покрытых коллагеном и ламинином. В целом, использованные авторами подходы позволили избавиться от соматических клеток (VASA-/vimentin+) и получить популяцию сперматогенных клеток-предшественниц (VASA+vimentin-).
[T. Scutella]

При дальнейшем культивировании полученной клеточной популяции формировались хорошо различимые колонии, которые по морфологии имели значительное сходство с колониями ЭСК человека, экспрессирующие факторы Oct4 и Sox2. В процессе культивирования данные колонии увеличивались в количестве и размерах.

Авторы доказали, что клетки каждой индивидуальной колонии ЭСК-подобных клеток экспрессируют маркеры чЭСК (Nanog, E-cad, Oct4, CD133, SSEA4), одновременно с маркерами сперматогеннных клеток (VASA, DAZL, CD49f), что было показано при иммуноцитохимическом окрашивании полученных колоний и сравнении экспрессии описанных выше маркеров с их экспрессией в гистологических срезах семенников. Сперматогенные клетки в ткани нормальных семенников экспрессировали CD133, SSEA4, VASA, DAZL, TSPYL2 и CD49f, однако были негативны по маркерам Nanog, e-cadherin, Oct4 и Stella. Свежевыделенные сперматогенные клетки характеризовались тем же паттерном экспрессии, однако их отличием была слабая экспрессия Oct4. Кроме того, авторы показали, что выраженная экспрессия Oct4 и SSEA4 в культивируемых клетках появлялась только при добавлении в среду фактора LIF, но не GDNF или комбинации GDNF и FGF2. Таким образом, при культивировании с LIF ССпК приобретали подобный ЭСК профиль экспрессии маркерных молекул.

При индукции дифференцировки в культуре по протоколам, используемым для ЭСК человека, клетки ЭСК-подобных колоний давали начало нейрональным, мышечным, остеогенным потомкам, а также инсулин- и глюкагон-продуцирующим клеткам поджелудочной железы, фактически ничем не отличаясь в этом отношении от ЭСК линии H1. После подкожной инъекции клеток ЭСК-подобных колоний от 8 доноров бестимусным мышам происходило формирование тератом, содержащих нейрональные, мышечные, эпидермальные и эктодермальные клетки, что было показано путем иммуногистохимического окрашивания.

Чтобы исключить вероятную контаминацию, проводилось определение микросаттелитных маркеров ДНК в образцах нуклеиновых кислот всех полученных линий клеток после завершения экспериментов и сравнение с профилем маркеров в клетках ЭСК человека линии H1. Во всех случаях контаминации не было обнаружено.

Для обозначения популяции полученных при длительном культивировании с фактором LIF сперматогенных клеток-предшественниц человека плюрипотентных ЭСК-подобных клеток авторы предлагают использовать термин «герминальные стволовые клетки взрослого человека» (human adult germline stem cells, human adult GSCs).

Появление способа получения плюрипотентных стволовых клеток из сперматогониальных клеток может дать новые возможности для их потенциального терапевтического применения. Их преимущество по перед, например, iPS-клетками состоит в отсутствии использования вирусных методов доставки генов плюрипотентности. Однако если рассматривать возможность аутогенной трансплантации таких клеток, то их использование будет ограничено рамками мужского пола.